摘要：【目的】對已克隆的海島棉U3和U6啟動子進行功能鑒定,為構建棉花CRISPR/Cas9多位點基因編輯技術體系提供更多可用的U3和U6啟動子。【方法】分別構建以GbU3-2P和GbU6-7P為啟動子驅動sgRNA,以抗旱負調控基因GGB為靶序列的CRISPR/Cas9基因編輯載體,然后在新海16的棉花葉片原生質體中進行功能鑒定。通過Polymerasechainreaction方法富集構建好的CRISPR/Cas9基因編輯載體的核心片段,并利用PEG瞬時轉化法將核心片段轉入原生質體中。提取轉化后的原生質體基因組DNA,采用酶切/Polymerase chain reaction法分析棉花GGB基因的突變情況并測序驗證。最后繪制靶基因突變的頻率分布圖來計算該CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率和確認突變的真實性。【結果】靶基因測序結果顯示靶標位點序列突變的類型全部為堿基替換。【結論】以GbU3-2P和GbU6-7P為啟動子的CRISPR/Cas9基因編輯體系可以成功地定點編輯棉花GGB基因的序列,引起基因突變。